IMUNO-HISTOQUÍMICA

 

A Imuno-histoquímica é um método de diagnóstico complementar amplamente utilizado na prática da anatomia patológica e que utiliza o princípio antígeno-anticorpo para determinar a expressão de biomarcadores específicos em diferentes tipos de células e tecidos. Possibilita uma análise semi-quantitativa de proteínas-alvos permitindo avaliar sua expressão, distribuição e localização.

A base da imuno-histoquímica é a reação antígeno-anticorpo, sendo o antígeno uma molécula, geralmente uma proteína ou polissacarídeo, capaz de deflagrar uma resposta imunológica com a produção de anticorpos que o reconhecem e estabelecem ligações. A porção do antígeno que interage com o anticorpo é chamada
de epítopo. 

Anticorpos

Para garantir a qualidade do exame, anticorpos primários de alta qualidade devem ser utilizados, devido a especificidade antigênica. Para garantir a especificidade, atenção especial deve ser dada ao clone utilizado, visto que a conformação da proteína pode mudar durante a reativação. 

Além disso, outro ponto de atenção é a utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais Anticorpos monoclonais se ligam à um único epítopo da proteína alvo, reduzindo a incidência de ligações não específicas. Já os policlonais, por se ligarem a vários epítopos da mesma proteína alvo, aumenta a sensibilidade por ser menos afetada pelas mudanças na conformação proteica após a recuperação antigênica e aumenta o sinal, por obter mais ligações.

O DB patologia utiliza apenas anticorpos padronizados e validados na plataforma Dako agilent. Todos os processos seguem um rígido processo de validação interna conforme preconizado pela Nordic immunohistochemical Quality
Control (NordiQC)

O anticorpo reconhece o antígeno pela especificidade de seu parátopo, desenhado para se ligar a epítopos particulares.

Métodos de detecção

Os anticorpos utilizados na técnica de imuno-histoquímica são marcados utilizando-se substâncias fluorescentes, enzimático cromogênico, radioativos ou ouro coloidal que são ligados a estes anticorpos, permitindo a visualização em microscópio comum ou de fluorescência, quando utilizados fluorocromos. Os métodos de detecção mais utilizados são:

1.  Método direto – o marcador é ligado ao anticorpo primário, que se liga diretamente ao antígeno alvo;
2. Método Indireto – além do anticorpo primário, é utilizado um anticorpo secundário e este está conectado ao marcador. Este método tem maior sensibilidade se comparado ao direto, pelo fato de os anticorpos secundários reagirem a diferentes antígenos presentes no anticorpo primário, o que leva a uma amplificação de sinal;
3. Método de Amplificação de Sinal – também conhecido como médico “Sanduiche” é o mais comum. Utiliza-se um anticorpo primário, um secundário e um marcador de complexo enzimático, em geral, o Avidina-Biotina ou por polímeros para amplificação do sinal visual.

Controle de Qualidade

A execução das técnicas de controle de qualidade é uma das etapas pré-analíticas mais importantes da imuno-histoquímica, por isso o DB conta com equipe técnica de profundo conhecimento e faz uso de reagentes padronizados e de alta qualidade.

No controle de qualidade devem ser avaliados tanto os reagentes como a viabilidade e fixação da amostra de tecido.

Para garantir a interpretação correta dos casos, é necessária a realização de controles positivos, sendo que a forma mais utilizada é o uso de amostras teciduais com expressão previamente conhecida para o marcador utilizado.

Da mesma forma, controles negativos são utilizados avaliando a especificidade do anticorpo, onde espera-se que não haja reações cruzadas.

Fatores pré-analíticos

A fase pré-analítica, assim como na maioria das técnicas diagnósticas, também é crucial para a imuno-histoquímica. O principal fator, neste caso, está relacionado à preservação do material por meio da fixação com formalina 10% tamponada.

Após coletado, o tecido inicia imediatamente um processo de autodigestão, chamado autólise, que degradará as células de forma irreversível e proporcional ao tempo até a fixação correta. Idealmente, o material deve ser colocado em formalina 10% tamponada imediatamente após a coleta.

Devido a essa fixação na formalina, ocorrem alterações conformacionais dos epítopos, por isso faz-se necessário o tratamento dos tecidos para a reorganização proteica, o que define o processo de recuperação antigênica.

A recuperação antigênica aumenta a sensibilidade do método, evitando falsos negativos e pode ser feito por digestão enzimática ou calor.

Aplicações

As aplicações mais comuns para a Imuno-histoquímica são:

• Confirmação diagnóstica;
• Classificação de tumores;
• Subtipagem de Linfomas e Leucemias;
• Diagnóstico de doenças infecciosas;
• Avaliação de mutações específicas;
• Diferenciação diagnóstica em neoplasias indiferenciadas;
• Predição de resposta terapêutica;
• Determinação de micrometástases;
• Determinação de sítio primário em neoplasias de origem desconhecida;
• Prognóstico de doenças;
• Pesquisa de infertilidade.

Sistemas Automatizados e Manuais

O processamento da imuno-histoquímica pode ser feito de forma manual ou automatizada.

Os métodos automatizados melhoram o fluxo de trabalho e têm as seguintes vantagens:

• Padronização das reações, sendo independente de habilidades individuais;
• Alta reprodutibilidade dos testes, garantida pelo seguimento rígido de protocolos;
• Melhoria do controle de erros, pela automação;
• Monitoramento constante do processo;

O DB Patologia utiliza um sistema automatizado da Dako – Agilent, líder global no segmento de diagnósticos.

Especialidades

Algumas especialidades como Neuropatologia, Sarcomas e Hematopatologia são reconhecidamente de grande complexidade, sendo a qualidade do resultado muito dependente da qualificação e especialização do Patologista. Todas são cobertas pelo DB Patologia.

Imuno-histoquímica no SUS e Saúde Suplementar

O exame de imuno-histoquímica está previsto tanto no SUS – Sistema Único de Saúde, quanto no sistema suplementar, no ROL de Procedimentos para cobertura mínima, divulgado pela ANS.

Nossos serviços

• Logística especializa e capilarizada, em todo território nacional
• Assessoria Médica e Científica
• Portfólio Completo de exames

 

Referências

NOVUS BIOLOGICAS. Immunohistochemistry (IHC) Handbook. Disponível em: http://images.novusbio.com/design/BR_IHCGuide_011017_web.pdf. Acesso em 2020.
TAYLOR, CR; RUDBECK, L. . Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako. https://www.agilent.com/cs/library/technicaloverviews/public/
08002_ihc_staining_methods.pdf
EXPEDEON – Immunohistochemistry Principles, uses and methods. Disponível em: https://www.expedeon.com/immunohistochemistry-principles-uses-and-methods-2/.
Acesso em 2020
FERRO, AB. Imunohistoquímica. [livro on line]. Lisboa: 2013. https://repositorio.ipl.pt/bitstream/10400.21/4569/1/Imunohistoqu%C3%ADmica.pdf